于是之在北京师范大学实验小学读书。之后，在首都师范大学附属中学读初中。1942年，参加北平青年组织的业余戏剧活动。

1944年，参加辅仁大学同学组织的沙龙剧团，并参演了个人首部话剧《牛大王》。1945年秋，考入北京大学西语系法文专业，学习不久后就辍学了，从此便正式参加了职业话剧团体，并参与了《蜕变》、《以身作则》等话剧的演出。

1947年，进入北平艺术馆工作，并参加了《上海屋檐下》、《大团圆》等话剧的演出。1949年2月，参加华北人民文工团（北京人民艺术剧院前身）。1951年，在话剧《龙须沟》中饰演鼓书艺人程疯子；同年，在歌剧《长征》中饰演毛泽东，而他也因此成为了新中国成立后最早饰演领袖毛泽东的演员。

1952年，加入中国共产党；同年，与于蓝、牛犇联袂主演剧情电影《龙须沟》。1958年，在话剧《茶馆》中饰演年轻精明的茶馆掌柜王利发。1959年，与谢芳等联合出演剧情电影《青春之歌》，在片中饰演地主阶

于是之的舅舅是石挥，妻子是李曼宜。2013年1月20日17时19分，于是之在北京协和医院逝世，享年86岁；1月24日，他的葬礼以灵车在首都剧场绕场一周的形式低调结束；1月25日，在北京人民艺术剧院举行追思会。

于是之的表演风格本色自然、含蓄深沉且富含诗意（杭州日报评）。他喜爱思想深刻，形象鲜明，生活气息浓厚的文艺作品。他追求真实、朴素、含蓄的艺术风格，厌恶虚假和娇柔造作。这种艺术趣味是形成于是之表演风格的重要因素。演员要忠实于生活，演戏要从生活出发，这是他艺术思想的核心。于是之创造的舞台形象，具有较深刻的思想感情，内在充实，性格丰满，色彩鲜明，重点在于他在艺术创造中始终尊重生活，严格遵循从生活出发的创作原则。于是之才创作人物时，总是调动起自己全部生活经验、社会知识和形象的积累，在自己的思想和感情的深处引发创造的热力。这就使他扮演的人物不是文学形象的舞台演绎而能通过出色的演员的二度创造，加深和风格文学形象的思想和性格。他对生活、对人物的深刻理解，常常使他的表演具有一种思想丰富，意境悠远，回味不尽的艺术魅力（《人民戏剧》评）。

2017年，为纪念于是之逝世四周年，作家出版社出版文学作品《于是之家书》和《于是之漫笔》。《于是之家书》精选了于是之1950-1980年代写给妻子李曼宜的书信。“家书”由李曼宜亲自编选，是于是之家书第一次较完整的结集出版，书信展现了老一辈知识分子做人做事的风貌。《于是之漫笔》为于是之的散文漫笔精选。“漫笔”由童道明编选。